此後6年間，他撰寫了《關於托勒密和哥白尼兩大世界體系對話》一書.1630年他第5次到羅馬，取得了此書的“出版許可證”。此書終於在1632年出版了。此書在表面上保持中立，但實際上卻為哥白尼體系辯護，並多處對教皇和主教隱含嘲諷，遠遠超出了僅以數學假設進行討論的範圍。全書筆調詼諧，在義大利文學史上列為文學名著。
《對話》出版後6個月，羅馬教廷便勒令停止出售，認為作者公然違背“1616年禁令”，問題嚴重，亟待審查。原來有人在教皇烏爾邦八世面前挑撥說伽利略在《對話》中，借頭腦簡單、思想守舊的辛普利邱之口以教皇慣用辭句，發表了一些可笑的錯誤言論，使他大為震怒。曾支援他當上教皇的集團激烈地主張要嚴懲伽利略，而神聖羅馬帝國和西班牙王國認為如縱容伽利略會對各國國內的異端思想產生重大影響，提出聯合警告。在這些內外壓力和挑撥下，教皇便不顧舊交，於這年秋髮出要伽利略到羅馬宗教裁判所受審的指令。
年近七旬而又體弱多病的伽利略被迫在寒冬季節抱病前往羅馬，在嚴刑威脅下被審訊了三次，根本不容審辯。幾經折磨，終於在1633年6月22日在聖瑪麗亞修女院的大廳上由10名樞機主教聯席宣判，主要罪名是違背“1616年禁令”和聖經教義。伽利略被迫跪在冰冷的石板地上，在教廷已寫好的“悔過書”上簽字。主審官宣佈：判處伽利略終身監禁；《對話》必須焚絕，並且禁止出版或重印他的其他著作。此判決書立即通報整個天主教世界，凡是設有大學的城市均須聚眾宣讀，藉此以一儆百。
伽利略既是勤奮的科學家，又是虔誠的天主教徒，深信科學家的任務是探索自然規律，而教會的職能是管理人們的靈魂，不應互相侵犯。所以他受審之前不想逃脫，受審之時也不公開反抗，而是始終服從教廷的處置。他認為教廷在神學範圍之外行使權力極不明智，但只能私下有所不滿。顯然，G.布魯諾的被處火刑和T.康帕內拉的被長期打入死牢，這兩位義大利傑出的哲學家的遭遇，給他精神上投下了可怕的陰影。
宗教裁判所的判決隨後又改為在家軟禁，指定由他的學生和故友A.皮柯羅米尼大主教在錫耶納的私宅中看管他，規定禁止會客，每天書寫材料均需上繳等。在皮柯羅米尼的精心護理和鼓勵下，伽利略重行振作起來，接受皮柯羅米尼的建議繼續研究無爭議的物理學問題。於是他仍用《對話》中的三個對話人物，以對話體裁，和較樸素的文筆，將他最成熟的科學思想和研究成果撰寫成《關於兩門新科學的對話與數學證明對話集》。兩門新科學是指材料力學（見彈性力學）和動力學。這部書稿1636年就已完成，由於教會禁止出版他的任何著作，他只好託一位威尼斯友人秘密攜出國境，1638年在荷蘭萊頓出版。
伽利略在皮柯羅米尼家中剛過了5個月，便有人寫匿名信向教廷控告皮柯羅米尼厚待伽利略。教廷乃勒令伽利略於當年12月遷往佛羅倫薩附近的阿切特里他自己的故居，由他的大女兒維姬尼亞照料，禁例依舊。她對父親照料妥貼，但4個月後竟先於父親病故。
伽利略多次要求外出治病，均未獲準。1637年雙目失明。次年才獲准住在其子家中。在這期間探望他的除托斯卡納大公外，還有英國著名詩人、政論家J.彌爾頓和法國科學家、哲學家P.伽桑迪。他的學生和老友B.卡斯泰裡還和他討論過利用木衛星計算地面經度的問題。這時教廷對他的限制和監視已明顯放鬆了。
1639年夏，伽利略獲准接受聰慧好學的18歲青年V.維維亞尼為他的最後一名學生，並可在他身邊照料，這位青年使他非常滿意。1641年10月卡斯泰裡又介紹自己的學生和過去的秘書E.托里拆利前往陪伴。他們和這位雙目失明的老科學家共同討論如何應用擺的等時性設計機械鐘，還討論過碰撞理論、月球的天平動、大氣壓下礦井水柱高度等問題，因此，直到臨終前他仍在從事科學研究。
伽利略於1642年1月8日病逝，葬儀草率簡陋，直到下一世紀，遺骨才遷到家鄉的大教堂。
科學的不斷發展，迫使羅馬教廷不得不在1757年宣佈解除對哥白尼《天體執行論》的禁令；1882年羅馬教皇又無可奈何地承認了日心學說。1979年11月10日，梵蒂岡教皇J.保羅二世代表羅馬教廷為伽利略公開平反昭雪，認為教廷在300多年前迫害他是嚴重的錯誤。這表明朝廷最終承認了伽利略的主張——宗教不應該干預科學。
伽利略是第一個把實驗引進力學的科學家，他利用實驗和數學相結合的方法確定了一些重要的力學定律。1582年前後，他經過長久的實驗觀察和數學推算，得到了擺的等時性定律。接著在1585年因家庭經濟困難輟學。離開比薩大學期間，他深入研究古希臘學者歐幾里得、阿基米德等人的著作。他根據槓桿原理和浮力原理寫出了第一篇題為《天平》的論文。不久又寫了論文《論重力》，第一次揭示了重力和重心的實質並給出準確的數學表示式，因此聲名大振。與此同時，他對亞里士多德的許多觀點提出質疑。
在1589～1591年間，伽利略對落體運動作了細緻的觀察。從實驗和理論上否定了統治千餘年的亞里士多德關於“落體運動法則”確立了正確的“自由落體定律”，即在忽略空氣阻力條件下，重量不同的球在下落時同時落地，下落的速度與重量無關。根據伽利略晚年的學生V.維維亞尼的記載，落體實驗是在比薩斜塔上公開進行的：1589年某一天，伽利略將一個重10磅，一個重1磅的鐵球同時拋下，幾乎同時落地，在場的競爭者個個目瞪口呆，在大笑中聳聳肩走了。但在伽利略的著作中並未明確說明實驗是在比薩斜塔上進行的。因此近年來對此存在爭議。
伽利略對運動基本概念，包括重心、速度、加速度等都作了詳盡研究並給出了嚴格的數學表示式。尤其是加速度概念的提出，在力學史上是一個里程碑。有了加速度的概念，力學中的動力學部分才能建立在科學基礎之上，而在伽利略之前，只有靜力學部分有定量的描述。
伽利略曾非正式地提出過慣性定律（見牛頓運動定律）和外力作用下物體的運動規律，這為牛頓正式提出運動第一、第二定律奠定了基礎。在經典力學的創立上，伽利略可說是牛頓的先驅。
伽利略還提出過合力定律，拋射體運動規律，並確立了伽利略相對性原理. 伽利略在力學方面的貢獻是多方面的。這在他晚年寫出的力學著作《關於兩門新科學的談話和數學證明》中有詳細的描述。在這本不朽著作中，除動力學外，還有不少關於材料力學的內容。例如，他闡述了關於梁的彎曲試驗和理論分析，正確地斷定梁的抗彎能力和幾何尺寸的力學相似關係。他指出，對長度相似的圓柱形梁，抗彎力矩和半徑立方成比例。他還分析過受集中載荷的簡支梁，正確指出最大彎矩在載荷下，且與它到兩支點的距離之積成比例。伽利略還對梁彎曲理論用於實踐所應注意的問題進行了分析，指出工程結構的尺寸不能過大，因為它們會在自身重量作用下發生破壞。他根據實驗得出，動物形體尺寸減小時，軀體的強度並不按比例減小。他說：“一隻小狗也許可以在它背上馱兩三隻同樣大小的狗，但我相信一匹馬也許連一匹和它同樣大小的馬也馱不起。”
他是利用望遠鏡觀測天體取得大量成果的第一位科學家。這些成果包括：發現月球表面凹凸不平，木星有四個衛星（現稱伽利略衛星），太陽黑子和太陽的自轉，金星、木星的盈虧現象以及銀河由無數恆星組成等。他用實驗證實了哥白尼的“地動說”，徹底否定了統治千餘年的亞里士多德和托勒密的“天動說”。
他一生堅持與唯心論和教會的經院哲學作鬥爭，主張用具體的實驗來認識自然規律，認為實驗是理論知識的源泉。他不承認世界上有絕對真理和掌握真理的絕對權威，反對盲目迷信。他承認物質的客觀性、多樣性和宇宙的無限性，這些觀點對發展唯物主義的哲學具有重要的意義。但由於歷史的侷限性，他強調只有可歸納為數量特徵的物質屬性才是客觀存在的。
伽利略因為支援日心說入獄後，“放棄”了日心說，他說，"考慮到種種阻礙，兩點之間最短的不一定是直線"，正是因為他有這樣的思想，暫時的放棄換得永遠的支援，沒有像布魯諾那樣去為科學的真理而犧牲，但卻可以為科學繼續貢獻自己的力量。
最早的溫度計是在1593年由義大利科學家伽利略（1564～1642）發明的。他的第一隻溫度計是一根一端敞口的玻璃管，另一端帶有核桃大的玻璃泡。使用時先給玻璃泡加熱，然後把玻璃管插入水中。隨著溫度的變化，玻璃管中的水面就會上下移動，根據移動的多少就可以判定溫度的變化和溫度的高低。溫度計有熱脹冷縮的作用所以這種溫度計，受外界大氣壓強等環境因素的影響較大，所以測量誤差較大。後來伽利略的學生和其他科學家，在這個基礎上反覆改進，如把玻璃管倒過來，把液體放在管內，把玻璃管封閉等。
在發現慣性定律的基礎上，伽利略提出了相對性原理：力學規律在所有慣性座標系中是等價的。力學過程對於靜止的慣性系和運動的慣性系是完全相同的。可以換句話說，在一系統內部所作任何力學的實驗都不能夠決定一慣性系統是在靜止狀態還是在作等速直線運動。伽利略在《對話》中寫道：當你在密閉的運動著的船艙裡觀察力學過程時，“只要運動是勻速的，決不忽左忽右擺動，你將發現，所有上述現象絲毫沒有變化，你也無法從其中任何一個現象來確定，船是在運動還是停著不動。即使船運動得相當快，在跳躍時，你將和以前一樣，在船底板上跳過相同的距離，你跳向船尾也不會比跳向船頭來得遠，雖然你跳到空中時，腳下的船底板向著你跳的相反方向移動。
你把不論什麼東西扔給你的同伴時，不論他是在船頭還是在船尾，只要你自己站在對面，你也並不需要用更多的力。水滴將象先前一樣，垂直滴進下面的罐子，一滴也不會滴向船尾，雖然水滴在空中時，船已行使了許多拃。魚在水中游向水碗前部所用的力，不比遊向水碗後部來得大；它們一樣悠閒地遊向放在水碗邊緣任何地方的食餌。最後，蝴蝶和蒼蠅將繼續隨便地到處飛行，它們也決不會向船尾集中，並不因為它們可能長時間留在空中，脫離了船的運動，為趕上船的運動顯出累的樣子。如果點香冒煙，則將看到煙象一朵雲一樣向上升起，不向任何一邊移動。
所有這些一致的現象，其原因在於船的運動是船上一切事物所共有的，也是空氣所共有的。”相對性原理是伽利略為了答覆地心說對哥白尼體系的責難而提出的。這個原理的意義遠不止此，它第一次提出慣性參照系的概念，這一原理被愛因斯坦稱為伽利略相對性原理，是狹義相對論的先導。
伽利略在帕多瓦大學工作的18年間，最初把主要精力放在他一直感興趣的力學研究方面，他發現了物理上重要的現象——物體運動的慣性；做過有名的斜面實踐，總結了物體下落的距離與所經過的時間之間的數量關係；他還研究了炮彈的運動，奠定了拋物線理論的基礎；關於加速度這個概念，也是他第一個明確提出的：甚至為了測量病人發燒時體溫的升高，這位著名的物理學家還在1593年發明了第一支空氣溫度計……但是，一個偶然的事件，使伽利略改變了研究方向。他從力學和物理學的研究轉向廣漠無垠的茫茫太空了。
那是1609年6月，伽利略聽到一個訊息，說是荷蘭有個眼鏡商人利帕希在一偶爾的發現中，用一種鏡片看見了遠處肉眼看不見的東西。“這難道不正是我需要的千里眼嗎？”伽利略非常高興。不久，伽利略的一個學生從巴黎來信，進一步證實這個訊息的準確性，信中說盡管不知道利帕希是怎樣做的，但是這個眼鏡商人肯定是製造了一個鏡管，用它可以使物體放大許多倍。
“鏡管！”伽利略把來信翻來覆去看了好幾遍，急忙跑進他的實驗室。他找來紙和鵝管筆，開始畫出一張又一張透鏡成像的示意圖。伽利略由鏡管這個提示受到啟發，看來鏡管能夠放大物體的秘密在於選擇怎樣的透鏡，特別是凸透鏡和凹透鏡如何搭配。他找來有關透鏡的資料，不停地進行計算，忘記了暮色爬上窗戶，也忘記了曙光是怎樣射進房間。